流式细胞仪原理(怎样利用PI单染色法进行流式细

一、基本原理

流式细胞仪检测细胞凋亡PI单染色法其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等。

二、试剂与仪器

1、PBS溶液

2、PI染液将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存

3、70%乙醇

4、400目筛网

5、流式细胞仪

三、实验步骤

1、收集细胞{数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

2、3ml PBS洗涤1次。

3、离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。

4、离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。

5、400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。

6、用1ml PI染液染色，4℃避光30min。

7、流式细胞仪检测PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

8、结果判断在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关;在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。

四、注意事项

细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。